Spoor #10 onder de loep
English version

Het NFI heeft van spoor #10 alleen gerapporteerd, dat spoor #10 overeenstemt met het profiel van Louwes. Verder niets. Pas tijdens de herzieningsaanvraag in 2006 kwam daar enige wijziging in. Uit de overlegde electroferogrammen werd het ten kantore van Prof. Mr. Knoops duidelijk, dat er op meerdere posities in het electroferogram extra piekjes zichtbaar waren, die uitgelegd konden worden als een minimaal spoor van DNA van het slachtoffer. Deze waren door de NFI-onderzoeker van het electroferogram speciaal gesignaleerd door middel van een zogenaamd am-label, dus added manually. In twee gevallen precies op posities, waar het slachtoffer in haar profiel dubbele pieken toonde: D3 en D8.
Deze reconstructie van het electroferogram van spoor #10 laat de ligging van de 11 loci zien, welke hieronder worden besproken aan de hand van de originele diagrammen.

De details uitvergroot

Hieronder is een vergelijking getrokken tussen alle posities (loci in het jargon) in het wangslijmprofiel van Louwes en in het profiel van spoor #10.

  1. De complicatie, die zich voordoet, als je probeert de extra bijdrage van een tweede persoon aan te tonen, is, dat het profiel van de eerste donor reeds een groot aantal posities bezet houdt. Er zijn twee soorten van bezetting mogelijk. Er kan een standaardpiek staan, zo'n piek wordt in het jargon een true allele genoemd. Valt de piek van de tweede persoon samen met de hoofdbijdrage, dan valt dit niet erg op. Toch is er nog een aanwijzing mogelijk. In ieder locus staan normaliter twee pieken, die in hoogte redelijk overeenstemmen. Redelijk, want er zijn om allerlei redenen wel degelijk balansverstoringen. Die balansverstoringen kunnen worden uitgedrukt in een verhouding. Verandert die verhouding in beduidende mate, dan kan men die als aanwijzing voor de toevoeging uit een andere bron beschouwen, mits natuurlijk de piek toeneemt, die overeenstemt met de extra bijdrage. Dat blijkt vijf keer het geval te zijn. Een keer zegt natuurlijk niets. Ook twee keer kan op toeval berusten. Maar vijf keer?
  2. De tweede soort bezetting wordt veroorzaakt door het vermenigvuldigingsproces van PCR. Er ontstaan daarbij extra piekjes, die bijna altijd vier base-eenheden korter zijn. In het jargon worden die backward stutters genoemd. Deze zijn typisch veel kleiner dan de pieken, waar ze aan voorafgaan, ze bereiken een hoogte van 5 tot 15% van de moederpiek. Tegenwoordig wordt voor iedere locatie nagegaan of deze piek binnen de voor zo'n stutterpiek geldende grenzen valt. In geval van overschrijding is dat een aanwijzing voor een extra bijdrage van een andere persoon. In vier gevallen is de stutterpiek groter geworden op de plek, waar een DNA-piek van het slachtoffer kan worden aangetroffen, zie ook appendix 1.
  3. In ongeveer vier gevallen - niet alle gevallen zijn even duidelijk - zien we pieken uit het profiel van het slachtoffer verschijnen op posities, die nog niet (duidelijk) werden ingenomen, dit zijn mogelijke true alleles. In twee gevallen staat de piek op de positie van een zogenaamde forward stutter. Dit type stutter is doorgaans zo laag (1 à 2 %), dat er niet serieus rekening mee behoeft te worden gehouden. Zie ook appendix 1.
We zien dus ongeveer op dertien plekken een afwijking in het profiel van spoor #10 in vergelijking tot het profiel van Louwes, steeds nawijsbaar als een mogelijk effect van de aanwezigheid van het profiel van mevrouw Wittenberg. Is dat veel? Nu, we moeten er rekening mee houden, dat dat profiel van mevrouw Wittenberg erg zwak is, 10 tot 20 maal zwakker dan dat van Louwes. Dat klopt ook, als we zien dat het bloedvlekje qua grootte en intensiteit maar 1/20 deel van heel monster #10 uitmaakt. Zie ook de paragraaf 6.3.2: Vlek #10 uitgerekend daarover.
Een dergelijke zwak spoor van het slachtoffer bevindt zich ook elders in het dossier, namelijk als spoor #6. In het referentie-profiel van mevrouw Wittenberg bevinden zich in totaal 18 pieken. In spoor #6 waren dit er maar twaalf of dertien. De overige pieken waren onzichtbaar geraakt, in het jargon worden dit drop-outs genoemd. In geval van één of een paar drop-outs wordt de waarschijnlijkheid van een match wel kleiner, maar blijft deze meestal toch zo groot, dat hieraan bewijskracht mag worden ontleend. Dus 13 markers ten gevolge van een extra bijdrage is eigenlijk best veel voor een dergelijk zwak spoor.

Overigens had je mogen verwachten, dat het NFI na het aantreffen van de eerste aanwijzingen dat er iets bijzonders aan de hand was (de am-kenmerken) meteen een aantal duplicaat-metingen van spoor #10 had uitgevoerd, liefst zowel op basis van het oorspronkelijke extract (waar 400 ?L van beschikbaar was, dus veel vergeleken met de later toegepaste extractie via QIAamp) als op basis van het PCR-product (waar je eventueel tientallen bepalingen mee kunt doen). Met meerdere metingen weet je gewoon veel meer. Of waren er wel meer metingen en werd er geselecteerd. Dat is niet zo'n rare veronderstelling, want de analyse-omstandigheden van spoor #10 wijken op twee punten af van wat de fabrikant adviseerde. Meestal werden de sporen in zo'n geval meerdere malen geanalyseerd en gepresenteerd. En dan denk je: hoe zagen de duplicaatmetingen er uit?
Ook bijzonder: Het FLDO werd ingeschakeld om de sporen #1 tot en met #9 nog eens te controleren. Toen de monsters naar Leiden werden verstuurd, was het NFI ook al klaar met de monsters van #10 tot en met #20, Waarom kreeg het FLDO die monsters niet???

En om nog even hier op door te gaan; in 2006 bestempelde het NFI spoor #42, dat dichtbij spoor #10 werd gevonden en wederom een minuscuul bloedvlekje bevatte, ook weer als enkelvoudig spoor van Louwes. Dit spoor ging wel naar het FLDO. En jawel hoor, hier vond het FLDO ook DNA-sporen van het slachtoffer. Andere bril? Andere ambitie?

Locus en referentiesporen

(zie Legenda onder de tabel)

referentie Louwes

spoor #10

veranderingen

D3
l  14 14
L 15 15
W 16 16

In spoor 10 is een true allele van W16W16 aanwezig op de forward stutterposite 16 van LL15. Forward stutters zijn doorgaans te laag om deze extra piek te verklaren. Het NFI markeerde terecht dit spoor, maar liet iedere bespreking ervan achterwege.

VWA
l  15 (16)
L 16 17
W 17 19

Balansverstoring. Locus VWA17 is in spoor #10 naar verhouding hoger dan in het referentieprofiel door een bijdrage van W17. De balans is omgepoold. W19 is onzichtbaar.

Locus en referentiesporen

referentie Louwes

spoor #10

veranderingen

D16
l  11 (12)
L 12 13
W 11 12

In dit locus zijn de beide bijdragen W11 en W12 nawijsbaar. W11 heeft de backward stutter l11 relatief verhoogd in waarde en boven de drempelwaarde getild. Tegelijkertijd heeft W12 de balans L12-L13 omgepoold.

D2
l  18 23
L 19 24
W 20 23

De bijdrage W20 is onzichtbaar, W23 kan hebben bijgedragen aan de stutter l23, waarvan de relatieve waarde is gestegen en daarmee boven de stutterdrempel geraakt.Merk op, dat hier geen ompoling in de piekbalans heeft plaatsgevonden, hiervoor is ook geen aanleiding.

Locus en referentiesporen

referentie Louwes

spoor #10

veranderingen

AmelXY
L X Y
W X X

In spoor 10 is de balans in piekhoogten  sterk omgepoold; dit kan - mede -  worden toegeschreven aan de extra bijdragen XX uit het profiel van W.

D8
l  7 12
L 8 13
W 14 14

Een true allel van W14W14 is zichtbaar en gemarkeerd op de positie van een forward stutter l14 van L13, waarbij de drempel voor een dergelijke stutter ruimschoots wordt overtroffen.

Locus en referentiesporen

referentie Louwes

spoor #10

veranderingen

D21

l  26 30
L 27 31
W 31 31.2

De onbalans van de posities L27 en L31 is vrijwel gelijkgetrokken, wellicht door de bijdrage van W31.  Voorts enige onverklaarde toevoegingen (24 en 29.2). W 31.2 lijkt onzichtbaar.

D18
l 12 22
L 13 23
W 15 17

W15 lijkt zichtbaar te zijn in spoor 10. Het totaalbeeld wordt gecompliceerd door het gegeven, dat in het referentiespoor en in dit spoor  een piekje op positie 18 zichtbaar is (verontreiniging?).

Locus en referentiesporen

referentie Louwes

spoor #10

veranderingen

D19

l 12 14
L 13 15
W 14 14.2

De bijdragen van W zouden zichtbaar moeten zijn op de posities 14 en 14.2. Op 14 is de stutterwaarde van l14 aanzienlijk gestegen (van 10% naar 13%, boven de zgn. stutterdrempel. Op 14.2 zijn in beide sporen kleine onregelmatigheden zichtbaar.

THO1
l 6 8.3
L 7 9.3
W 7 7

Op dit locus is een kleine ompoling van de piekenbalans zichtbaar, in principe in overeenstemming met de bijdrage van W7 W7. Stutters zijn niet relevant en daarnaast minimaal.

Locus en referentiesporen

referentie Louwes

spoor #10

veranderingen

FGA

l 22 22
L 24 24

W 22 24

De bijdrage W22 kan ertoe hebben bijgedragen, dat de stutter l22 22 verhoudingsgewijs veel hoger is geworden en daarmee boven de stuttergrens is gestegen. De eventuele piek van W 24 is heel onduidelijk.

Legenda
* duidt op pieken met lage RFU in spoor #10(met overeenkomstige positiemarkering in referentiespoor)
l
 staat voor stutterpieken van Louwes. Vanwege de lage RFU-waarden voor de pieken van het slachtoffer, zijn de posities van die stutters hiervan niet aangegeven.
L staat voor de posities van true alleles van Louwes.
W voor de posities idem van het slachtoffer.
xx piek die wel zichtbaar is in spoor #10 maar niet in de referentie van Louwes.


Een vergelijking van spoor #10 met het gebruikte referentiespoor van Louwes levert een aantal verschiillen op, die kunnen worden weergegeven in een nieuw electroferogram. Op vijf posities ontbreekt ieder spoor van het slachtoffer, maar dat is in meerdere profielen uit de gemeten reeks zichtbaar. De resterende posities rechtvaardigingen de vaststelling, dat de aanwezigheid van het profiel van het slachtoffer in spoor #10 niet kan worden uitgesloten.
M.a.w., spoor #10 is geen enkelvoudig profiel, waardoor de noodzaak vervalt, om spoor #10 met de zichtbare bloedvlek te identificeren.
Deze identificatie is ook kwestieus, indien men de sterktes van de pieken in de overwegingen betrekt, zoals gedaan in de paragraaf rekenen.


Het electroferogram van spoor #06 vertoont een gelijksoortig aantal pieken van geringe schaalgrootte. Dit spoor werd als partieel profiel toegewezen aan het slachtoffer op basis van een frequentie van minder dan 1 op 1 miljard (NFI rapport 5 december 2003). Het komt op 11 of 12 posities (uit 17) overeen met het autosomale profiel van mevrouw Wittenberg en scoort daarmee overeenkomstig de overeenstemmingen van spoor #10 met het profiel van mevrouw Wittenberg, zoals gemarkeerd in het profiel hierboven.

Het overzicht behouden

Er is ook een andere benadering mogelijk. We kunnen alle pieken en piekjes van spoor #10 vergelijken met het wangslijmspoor van Louwes en statistsch berekenen, in hoeverre zij dan overeenstemmen.Die overeenstemming is groot, nogal voor de hand liggend, want spoor #10 is zowel in de visie van OM en NFI, als in de visie van de verdediging voornamelijk samengesteld uit DNA van Louwes:
 Horizontaal zijn de piek hoogtes opgezocht in het gemiddelde wangslijmprofiel van Louwes (er werden twee monsters genomen) en vertikaal de overeenkomstige piekhoogten in spoor #10. De correlatie blijkens de R-kwadraat-test is zeer hoog (het maximum  is 1). De inzet laat zien, dat in het segment met lage pieken de correlatie juist heel zwak is.

Vervolgens is een hypothetisch profiel berekend. Dit ging als volgt: aan het gemiddelde DNA-spoor van Louwes' wangslijm werd 1/6 van het referentiespoor van het slachtoffer toegevoegd. Omdat het referentiespoor van W ongeveer drie maal zo zwak is als het referentiespoor van Louwes dat hier is gebruikt, komt dit erop neer dat het DNA-gehalte van W ongeveer 1/20 bedraagt ten opzichte van het gehele spoor, precies zoals reeds werd verondersteld op basis van afmetingen en intensiteit van het bloedspoor in de monstername. Zie nogmaals de paragraaf Vlek #10 uitgerekend daarover. Deze aanpassing zal het hierboven getoonde resultaat niet direct omver werpen. Maar toch stijgt de correlatie nog aanmerkelijk. Ook langs deze weg kan worden aangetoond dat de hypothese dat spoor #10 een samengesteld DNA-spoor is, superieur is aan de hypothese dat het enkelvoudig is.
 Horizontaal zijn de piek hoogtes opgezocht in het  berekende profiel van Louwes met ongeveer 5% bijmenging Met DNA van het slachtoffer. Deze zijn vergeleken met vertikaal de overeenkomstige piekhoogten in spoor #10. De correlatie blijkens de R-kwadraat-test is nog hoger (het maximum  is 1), de correlatie is beter. In het segment met lage RFU-waarden is de correlatie beduidend beter dan in het voorgaande geval.

De likelihood ratio  

Er bestaat een methode om het bewijs van de aanklager te vergelijken met het bewijsverweer van de verdediging. Daartoe vergelijkt men twee invalshoeken. Hp (p = prosecutor) is een waardering voor de hypothese van de aanklager. Hd is de waardering voor de hypothese van de verdediging (d = defence). De verhouding  LR = Hp/Hd probeert de sterkte van het bewijs te wegen. Deze verhouding wordt geacht flink door te slaan naar de aanklager, want de verdediging mag zich beroepen op de onschulpresumptie. Per slot van rekening kunnen er nog heel veel andere verdachten zijn.
De vraag blijft natuurlijk, hoe verkrijg je voor dit quotiënt een waarde? In het geval dat DNA een rol speelt zijn hiervoor rekenkundige technieken beschikbaar, tegenwoordig ondersteund door digitale technieken. Waarmee de bewijsvoering automatisch ondoorzichtig wordt. Maar de principes hierin zijn duidelijk. Men vergelijkt niet alleen voorkomens van pieken, maar ook details, als het verhogen van stutterpieken en het verstoren van piekbalansen, precies zoals hierboven is gepresenteerd. Ook vergelijkt men de totale uitkomst van de profielen, analoog aan het berekenen van de correlatie, zoals hierboven gedemonstreerd.
Voor deze casus lijkt geen twijfel mogelijk, Hp is inferieur aan Hd, gewoon, omdat Hd geen absolute waarheid verkondigt en Hp wel, namelijk, dat spoor #10 geen andere bijdragen kent. Een bewering, die zich niet laat bevestigen met zoveel kleine aanwijzingen van het tegendeel.
Ja, het zijn aanwijzingen. Maar bedenk, dat men aanwijzingen kan stapelen. Stel je eens voor dat iedere hier aangewezen aanwiijzing in spoor #10 voor 90% als onwaarschijnlijk kan worden gekenmerkt. Dan nog speelt het een beslissende rol, dat er meer dan 10 aanwijzingen zijn gevonden dat de Hp niet helemaal klopt. Ofwel, de kans dat de Hp wel klopt < (0,9)10 = 0,35. En dan heb ik de Hp nog veel te rooskleurig voorgesteld!
Heeft Hd dan ook niet met een dergelijke rekensom te maken? Nee dus. Want het vaststellen van een toevoeging op enig locus in het spoor is al voldoende, om vast te stellen, dat het spoor verontreinigd is. Als op enig locus de kans redelijk groot is, legt dat onmiddellijk een bodem in de waarde voor Hd. Als daar nog meer aanwijzingen bijkomen, dan verhoogt dat automatisch die bodem. Uitgaande van bovenstaan voorbeeld levert dit uiteindelijk een waarde van 1 - 0,35 > 0,65, want beide proposities sluiten elkaar wederzijds uit (spoor #10 is zuiver of onzuiver, meer smaken zijn er in dit opzicht niet).
En dan hebben we het natuurlijk nog niet gehad over de vele andere kronkels in het DNA - bewijs, waar de rest van het hoofdstuk DNA over handelt.

Appendix 1: Stutterhoogtes

Backward stutters



De vier pieken die zijn gerelateerd aan backward stutters vertonen piekhoogten die de in de handleiding van het SGMplus systeem opgesomde stutterhoogtes uit validatiemetingen meerdere malen ruim overtreffen, zowel vergeleken met de medianen als met de maxima. Merk op dat de gegevens verwijzen naar de pieken, waar de stutters van zijn afgeleid (dus 1 positie hoger dan de stutter zelf). Ten opzichte van de gemiddelde stutterhoogtes is er sprake van een toename van circa 4 tot 9 %, hetgeen goed correspondeert met de eerder gevonden waarde van de bijmenging van het profiel van mevrouw Wittenberg aan het profiel van Louwes van 5 tot 10 %.

Forward stutters


De forward stutter in D3 is maximaal 1% hoog (open cirkels), dan wel RFU 40 (dichte cirkels) op de aangegeven positie (rode verticale lijn). In spoor #10 staat daar een piek van  RFU 94, ofwel 2,2%, dus dubbel zo hoog. Deze piek past in het profiel van W als homozygote piek. De forward stutter in D8 is maximaal 2% hoog, met een RFU van 40 op de aangegeven positie (rode verticale lijn). In spoor #10 staat daar een piek van RFU 115, of wel 4,4%, dus weer dubbel zo hoog. Ook deze piek past in het profiel van W en wel weer homozygoot.

Een combinatie


Een speciaal geval vormt piek 14 in locus D19, aangezien deze op zowel een forward stutter van L13, als op een backward stutter van L15 steunt. De backward stutter vertoont gemiddeld een bijdrage van 8% van RFU 1309 = 105 RFU. De forward stutter levert een bijdrage van circa 30 RFU. De gemeten piek ligt op 173 RFU, dus weer 40 RFU eenheden hoger.

Appendix 2: Piekhoogteratio (PHR)

De hoeveelheid verschuiving is uitgedrukt ten opzichte van de standaarddeviatie in de validatiewaarden. Bij een normale verdeling brengt een verschuiving van 2 x SD een meetwaarde vanuit het centrum in een zone met 2,5% waarschijnlijkheid. Door de speciale definitie van PHR is de verdeling vermoedelijk niet normaal, maar de verschuiving overtreft de 2xSD veelal zo ruim, dat je deze toch als significant kunt bestempelen.
 De meeste loci vertonen twee grote pieken van Louwes (heterozygoot en XYamel). De uitzonderingen zijn gemarkeerd (homozygoot). In principe behoren de twee pieken allebei even hoog te zijn. In de praktijk is er altijd verschil; de kolom PHR (piekhoogteratio) geeft de meest waarschijnlijke onbalans tussen klein en groot weer op basis van een een aantal validatiemetingen door de fabrikant van het meetsysteem SGM plus, dat het NFI gebruikte. Er zijn per meting 50 tot 100 meetwaarden gebruikt. De tabel meldt niet of de linker, dan wel rechter piek het grootst zal zijn.
Uit de gegevens van het NFI in de Deventer Moordzaak is de PHR van de gemiddelde referentie van Louwes bepaald. Deze schommelen uitaard veel meer (kleinere steekproef) en de gemarkeerde waarde van D18S51 valt door de mand. Mogelijk speelt hier de extreem grote afstand tussen de posities een rol. Dit heeft geen gevolgen, want op dit locus wordt de PHR niet verstoord door een toevoeging van DNA van het slachtoffer. Waar dat wel verwacht mag worden is een gele markering aangebracht.
De kolom spoor #10 toont de PHR in dit spoor, waarbij de volgorde klein-groot van de voorgaande kolom is gehandhaafd. De veronderstelde toevoeging van DNA van W in dit spoor leidde vrijwel steeds tot ompoling van de PHR, de kleinste piek werd (bijna) steeds nu de grootste. Dat de bijdrage van W steeds op de kleinste piek valt is een toeval dat het resultaat alleen maar verduidelijkt; de ompoling.