DNA extractie

Tussen het aanwijzen van een monster en het produceren van een DNA-profiel hieruit zitten meerdere stappen. Eerst moet het DNA uit het monster worden losgeweekt. Een dergelijke stap heet extractie. Vervolgens moet dit resultaat worden gezuiverd van ongewenste stoffen. Deze stap heeft geen aparte naam gekregen, omdat deze vaak 'in ťťn moeite door' wordt uitgevoerd met de voorafgaande. Het resultaat van de extractie en zuivering wordt in een PCR-routine sterk vermenigvuldigd, waarna electroforese kan worden toegepast.

De eerste stap van de 'DNA-extractie', het losweken, is een extractie in engere zin. Hierbij wordt het monster ondergedompeld in een vloeistof, die dusdanig is gekozen, dat het DNA hier graag in oplost en de celwanden kapot gaan. Gewoon koken in gedestilleerd water is een mogelijkheid.
De tweede stap kan verschillend zijn. Er zijn meerdere methoden, waarbij in de Deventer Moordzaak er twee zijn toegepast. Bij de eerste methode worden de onzuiverheden uit het extract 'gevist', waarna het overblijfsel gebruikt wordt voor PCR: de Chelex-methode. Bij de tweede methode wordt juist het DNA uit de oplossing gevist en vervolgens geschikt gemaakt voor PCR: hiervoor werd QIAamp gebruikt. Uit de naam kan al worden afgeleid, dat daarbij een meer geconcentreerde oplossing van DNA vrijkomt. Dit kan interessant zijn,omdat de PCR-opstelling maar een beperkt volume aan DNA-oplossing kan verwerken.

Chelex

In een klein centrifuge buisje worden het monster en een suspensie van Chelex 100 samengebracht en tot 100 oC verhit. Vervolgens wordt het buisje gecentrifugeerd, zodat alle vaste substanties onder in het buisje 'vastkleven'. De bovenstaande oplossing is nu bruikbaar voor PCR. In de neergeslagen Chelex-korrels zitten nu de verontreinigingen. Deze blijven dus achter. De methode is eenvoudig en snel. Er ontstaat vrij veel oplossing, die dus behoorlijk verdund is. Problematisch is nog, dat er meerdere recepten bestaan om Chelex toe te passen, met name, indien het monster vast zat op een ondergrond. Hoe het NFI te werk ging staat niet vast.

QIAamp

De invalshoek is nu precies tegengesteld. Het DNA wordt uit de oplossing gevist. Zo bestaat er nu geen onzekerheid meer over eventuele onzuiverheden. Om het DNA uit de oplossing te verdringen, wordt het DNA eerst losgeweekt van de ondergrond (en eventueel uit de cel) en vervolgens behandeld met een sterke zoutoplossing in de nabijheid van vast siliciumoxide. Het DNA hecht zich daarbij aan dat siliciumoxide. Dit siliciumoxide wordt vervolgens uit de oplossing gevist. Met gewoon (gedestilleerd) water wordt het DNA vervolgens weer van het siliciumoxide losgeweekt. Door het volume van dit gedestilleerde water sterk te beperken, is het mogelijk een veel meer geconcentreerde oplossing van de DNA-oplossing te verkrijgen. Vandaar de gehanteerde handelsnaam QIAamp. Omdat de ontvangende routine, de PCR, maar een beperkte volume aankan, is het nu mogelijk met meer DNA het PCR-proces in te gaan. De QIAamp procedure gaat met veel meer handelingen gepaard. Deze kunnen tegenwoordig door een robot worden uitgevoerd, die ook nog eens heel efficiŽnt werkt.

Toepassing in de Deventer Moordzaak

In het onderzoek werden beide methoden toegepast, hetgeen in principe kon leiden tot extra verwarring en dat ook heeft gedaan. Op grond van de nummering van de extracten, zou men kunnen denken, dat behalve spoor #10, alle andere sporen werden geŽxtraheerd met QIAamp. Alle electroferogrammen, behalve spoor #10 zijn gemerkt met een extractienummer, beginnend met een Q. Ook op het zakenformulier, gepubliceerd door Derksen (zie paragraaf 6.1.1) zijn de sporen #11 t/m #19 gemerkt met een Q (Q03/622/05 ev), maar spoor #10 niet (03/621/19). Uit andere bron blijkt, dat ook de sporen #1 tm #9 met Chelex werden geŽxtraheerd en gezuiverd.
Meest waarschijnlijk is het dus, dat #1 t/m #10 Chelex ondergingen en #11 tm #20 QIAamp. In paragraaf 6.1.1 is al uiteengezet, dat hierdoor het NFI in 2006 vermoedelijk met een onjuiste modelberekening voor de hoeveelheid celmateriaal in vlek #20 kwam.

Chelex versus QIAamp

Beide methoden verschillen wezenlijk, het behoeft dan ook niet te verwonderen, dat de uitkomsten van een vergelijking tussen beide methoden niet altijd gelijk uitvallen. De methoden zijn onder allerlei omstandigheden met elkaar vergeleken, hetgeen een verwarrend beeld oplevert. Hier concentreer ik mij op de vergelijking met betrekking tot de efficiŽntie van extractie van oude bloedvlekken, zoals dat een rol speelt bij vlek #10. Om in de herinnering terug te roepen: in vlek #10 was het volledige profiel van Louwes zichtbaar en daarnaast wat spoortjes van het profiel van het slachtoffer. Deze spoortjes werden 'gemakshalve' maar gewoon niet gerapporteerd. Deze spoortjes waren ook wel een stuk lager in intensiteit dan de sporen van Louwes. Bij de bespreking van dit spoor in de bovenliggende paragraaf heb ik er al op gewezen, dat de potentiŽle bron van het DNA van Louwes (speeksel op een stuk blouse van 1 cm2) wel een stuk omvangrijker was dan de potentiŽle bron van de DNA-sporen van het slachtoffer: een vlekje van < 10 mm2. Uit de onderstaande bronnen volgt daarenboven, dat Chelex het behoorlijk laat afweten bij het extraheren van oude bloedvlekken, dus dat de sporen van het slachtoffer veel duidelijker hadden kunnen zijn, als QIAamp was gebruikt.

Bron 1:
Greenspoon SA, Scarpetta MA, Drayton ML, Turek SA. QIAamp spin columns as a method of DNA isolation for forensic casework. J Forensic Sci 1998;43(5):1024–1030.

A matrix study was performed to determine if the QIAamp DNA procedure would give better results on bloodstains deposited on ‘‘problem surfaces’’ such as leather, dirt and various dyed fabrics (*). Again, QIAamp isolated DNA was more readily typeable than Chelex isolated DNA.


Bron 2:
Effects of Storage Temperature and Humidity Control on the Recovery of DNA From Aged Bloodstains - Margaret Kline et al - AAFS 54th Annual Meeting Feb 11-16, 2002.

Hierin komt de volgende veelzeggende illustratie voor:



Dit plaatje laat zien, dat Chelex er niet in slaagt om de helft van het DNA uit een oude bloedvlek op papier te halen. Voor katoen zal dit niet veel anders liggen, de chemische samenstelling van katoen en papier is immers identiek. De bloedvlek van spoor #10 was minder oud, maar toch oud genoeg, om te kunnen stellen dat de sporen uit de bloedvlek zelf zomaar tweemaal zo hoog hadden kunnen zijn. En dan had het NFI die sporen niet kunnen negeren en volgens mijn reconstructie spoor #10 nůůůit uitsluitend aan Louwes kunnen toeschrijven. Het geeft tevens een - vierde - verklaring voor het ontbreken van sporen van het slachtoffer in de rechter helft van het electroferogram. Overigens is de oorzaak van dit verschijnsel wel voor de hand liggend, maar niet per se juist. (**)

Bron 3:
DNA typing from 15-year-old bloodstains - A. Barbaro et al - International Congress Series 1288 (2006) 550–552.

Systems based on silica membrane columns (***) like NucleoSpin kit constitutes an excellent and rapid method of purification. It gave the best results in comparison with the other methods being able to elute totally the stain and to purify completely the sample. In fact, we obtained full DNA profiles, with balanced peaks, low noise and high reproducibility. (..) Chelex represents the optimal method when referred to low cost and rapidity of execution in a single tube. The main problem using Chelex for DNA extraction from old blood traces is to make the stain soluble: since the reagent is not very strong, the procedure requires a prolonged incubation time to elute the trace. In fact, DNA profiles obtained following the traditional extraction procedure showed only few loci, while by adding an aliquot of proteinase K about 10 mg/ml and with a prolonged incubation time, better profiles were obtained.


Hoeveel tijd het NFI stak in spoor #10 stak, laat zich raden. In ieder geval refereerde het NFI meerdere malen aan tijdgebrek. Deze bronnen geven een verklaring voor het mindere resultaat van Chelex.


Nu is het mijn stelling - in verweer tegen het geleverde bewijs - dat het DNA van Louwes uit speeksel stamt en het DNA van het slachtoffer - nauwelijks zichtbaar - uit het bloedvlekje. De afbeelding laat zien, dat de ondermaatse aanwezigheid van het DNA van het slachtoffer deels verweten mag worden - totdat het tegendeel bewezen wordt - aan het slecht functioneren van Chelex bij bloedvlekken.

(*) 
Ook de blouse valt in deze categorie, immers was de vezel gevuld met titaanoxide om deze witter te maken.
(**) Op het moment, dat het DNA van de ondergrond wordt losgeweekt, vormen de allelen nog een onderdeel van de DNA-streng, zodat de lengte nog geen dominerende rol kan spelen wat betreft de bindingskracht.
(**) Ook QIAamp is een toepassing van deze technologie.