DNA extractie
Tussen het aanwijzen van een monster en
het
produceren van een DNA-profiel hieruit zitten meerdere stappen. Eerst
moet het DNA uit het monster worden losgeweekt. Een dergelijke stap
heet extractie. Vervolgens moet dit resultaat worden gezuiverd van
ongewenste stoffen. Deze stap heeft geen aparte naam gekregen, omdat
deze vaak 'in één moeite door' wordt uitgevoerd met de voorafgaande.
Het resultaat van de extractie en zuivering wordt in een PCR-routine sterk vermenigvuldigd, waarna electroforese kan worden toegepast.
De
eerste stap van de 'DNA-extractie', het losweken, is een extractie in
engere zin. Hierbij wordt het monster ondergedompeld in een vloeistof,
die dusdanig is gekozen, dat het DNA hier graag in oplost en de
celwanden kapot gaan. Gewoon koken in gedestilleerd water is een
mogelijkheid.
De tweede stap kan verschillend zijn. Er zijn meerdere methoden,
waarbij in de Deventer Moordzaak er twee zijn toegepast. Bij de eerste
methode worden de onzuiverheden uit het extract 'gevist', waarna het
overblijfsel gebruikt wordt voor PCR: de Chelex-methode.
Bij de tweede methode wordt juist het DNA uit de oplossing gevist en
vervolgens geschikt gemaakt voor PCR: hiervoor werd QIAamp
gebruikt. Uit de naam kan al worden afgeleid, dat daarbij een meer
geconcentreerde oplossing van DNA vrijkomt. Dit kan interessant
zijn,omdat de PCR-opstelling maar een beperkt volume aan DNA-oplossing
kan verwerken.
Chelex
In een klein centrifuge buisje worden
het monster en
een suspensie van Chelex 100 samengebracht en tot 100 oC
verhit. Vervolgens wordt het buisje gecentrifugeerd, zodat alle vaste
substanties onder in het buisje 'vastkleven'. De bovenstaande oplossing
is nu bruikbaar voor PCR. In de neergeslagen Chelex-korrels zitten nu
de verontreinigingen. Deze blijven dus achter. De methode is eenvoudig
en snel. Er ontstaat vrij veel oplossing, die dus behoorlijk verdund
is. Problematisch is nog, dat er meerdere recepten bestaan om Chelex
toe te passen, met name, indien het monster vast zat op een ondergrond.
Hoe het NFI te werk ging staat niet vast.
QIAamp
De invalshoek is nu precies
tegengesteld. Het DNA wordt uit de oplossing gevist. Zo bestaat er nu
geen onzekerheid meer over eventuele onzuiverheden. Om het DNA uit de
oplossing te verdringen, wordt het DNA eerst losgeweekt van de
ondergrond (en eventueel uit de cel) en vervolgens behandeld met een
sterke zoutoplossing in de nabijheid van vast siliciumoxide. Het DNA
hecht zich daarbij aan dat siliciumoxide. Dit siliciumoxide wordt
vervolgens uit de oplossing gevist. Met gewoon (gedestilleerd) water
wordt het DNA vervolgens weer van het siliciumoxide losgeweekt. Door
het volume van dit gedestilleerde water sterk te beperken, is het
mogelijk een veel meer geconcentreerde oplossing van de DNA-oplossing
te verkrijgen. Vandaar de gehanteerde handelsnaam QIAamp. Omdat de ontvangende routine,
de PCR, maar een beperkte volume aankan, is het nu mogelijk met meer
DNA het PCR-proces in te gaan. De QIAamp procedure gaat met veel meer
handelingen gepaard. Deze kunnen tegenwoordig door een robot worden
uitgevoerd, die ook nog eens heel efficiënt werkt.
Toepassing in de Deventer Moordzaak
In het onderzoek werden beide
methoden toegepast, hetgeen in principe kon leiden tot extra verwarring
en dat ook heeft gedaan. Op grond van de nummering van de extracten,
zou men kunnen denken, dat behalve spoor #10, alle andere sporen werden
geëxtraheerd met QIAamp. Alle electroferogrammen, behalve spoor #10
zijn gemerkt met een extractienummer, beginnend met een Q. Ook op het
zakenformulier, gepubliceerd door Derksen (zie paragraaf 6.1.1) zijn de
sporen #11 t/m #19 gemerkt met een Q (Q03/622/05 ev), maar spoor #10
niet (03/621/19). Uit andere bron blijkt, dat ook de sporen #1 tm #9
met Chelex werden geëxtraheerd en gezuiverd.
Meest waarschijnlijk is het dus, dat #1 t/m #10 Chelex ondergingen en
#11 tm #20 QIAamp. In paragraaf 6.1.1 is al uiteengezet, dat hierdoor
het NFI in 2006 vermoedelijk met een onjuiste modelberekening voor de
hoeveelheid celmateriaal in vlek #20 kwam.
Chelex versus QIAamp
Beide methoden verschillen wezenlijk, het behoeft dan ook niet te
verwonderen, dat de uitkomsten van een vergelijking tussen beide
methoden niet altijd gelijk uitvallen. De methoden zijn onder allerlei
omstandigheden met elkaar vergeleken, hetgeen een verwarrend beeld
oplevert. Hier concentreer ik mij op de vergelijking met betrekking tot
de efficiëntie van extractie van oude bloedvlekken, zoals dat een rol
speelt bij vlek #10. Om in de herinnering terug te roepen: in vlek #10
was het volledige profiel van Louwes zichtbaar en daarnaast wat
spoortjes van het
profiel van het slachtoffer. Deze spoortjes werden 'gemakshalve' maar
gewoon niet gerapporteerd. Deze spoortjes waren ook wel een stuk lager
in intensiteit dan de sporen van Louwes. Bij de bespreking van dit
spoor in de bovenliggende paragraaf heb ik er al op gewezen, dat de
potentiële bron van het DNA van Louwes (speeksel op een stuk blouse van
1 cm2) wel een stuk omvangrijker was dan de potentiële bron
van de DNA-sporen van het slachtoffer: een vlekje van < 10 mm2.
Uit de onderstaande bronnen volgt daarenboven, dat Chelex het
behoorlijk laat afweten bij het extraheren van oude bloedvlekken, dus
dat de sporen van het slachtoffer veel duidelijker hadden kunnen zijn, als QIAamp was gebruikt.
Bron 1:
Greenspoon SA, Scarpetta MA, Drayton
ML, Turek SA. QIAamp spin columns as a method of DNA isolation for
forensic
casework. J Forensic Sci 1998;43(5):1024–1030.
A matrix study was performed to determine if the QIAamp DNA procedure
would give better results on bloodstains deposited on ‘‘problem
surfaces’’ such as leather, dirt and various dyed fabrics (*). Again,
QIAamp isolated DNA was more readily typeable than Chelex isolated DNA.
Bron 2:
Effects of Storage Temperature and
Humidity Control on the Recovery of DNA From Aged Bloodstains -
Margaret Kline et al - AAFS 54th Annual Meeting Feb 11-16, 2002.
Hierin komt de volgende veelzeggende illustratie voor:
Dit plaatje laat zien, dat Chelex er
niet in slaagt om de helft van het
DNA uit een oude bloedvlek op papier te halen. Voor katoen zal dit niet
veel anders liggen, de chemische samenstelling van katoen en papier is
immers identiek. De bloedvlek van spoor #10 was minder oud, maar toch
oud genoeg, om te kunnen stellen dat de sporen uit de bloedvlek zelf
zomaar
tweemaal zo hoog hadden kunnen zijn. En dan had het NFI die sporen niet
kunnen negeren en volgens mijn reconstructie spoor #10 nóóóit
uitsluitend aan Louwes kunnen toeschrijven. Het geeft tevens een -
vierde - verklaring voor het ontbreken van sporen van het slachtoffer
in de rechter helft van het electroferogram. Overigens is de oorzaak
van dit verschijnsel wel voor de hand liggend, maar niet per se juist.
(**)
Bron 3:
DNA typing from 15-year-old
bloodstains - A. Barbaro et al - International Congress Series 1288
(2006) 550–552.
Systems based on silica membrane columns (***) like NucleoSpin kit
constitutes an excellent and rapid method of purification. It gave the
best results in comparison with the other methods being able to elute
totally the stain and to purify completely the sample. In fact,
we
obtained full DNA profiles, with balanced peaks, low noise and high
reproducibility. (..)
Chelex represents the optimal method when referred to low cost and
rapidity of execution in a single tube. The main problem using Chelex for DNA
extraction from old blood traces is to make the stain soluble: since
the reagent is not very strong, the procedure requires a prolonged
incubation time to elute the trace. In fact, DNA profiles
obtained following the traditional extraction procedure showed only few
loci, while by adding an aliquot of proteinase K about 10 mg/ml and
with a prolonged incubation time, better profiles were obtained.
Hoeveel tijd het NFI stak in spoor
#10 stak, laat zich raden. In ieder
geval refereerde het NFI meerdere malen aan tijdgebrek. Deze bronnen geven
een verklaring voor het mindere resultaat van Chelex.
Nu is het mijn stelling - in verweer tegen het geleverde bewijs - dat
het DNA van Louwes uit speeksel stamt en het DNA van het slachtoffer -
nauwelijks zichtbaar - uit het bloedvlekje. De afbeelding laat zien,
dat de ondermaatse aanwezigheid van het DNA van het slachtoffer deels
verweten mag worden - totdat het
tegendeel
bewezen wordt
- aan het slecht functioneren van Chelex bij bloedvlekken.
(*)
|
Ook de blouse valt in deze categorie, immers was de vezel gevuld met titaanoxide om deze witter te maken. |
(**) |
Op het moment, dat het DNA van de ondergrond wordt
losgeweekt, vormen de allelen nog een onderdeel van de DNA-streng,
zodat de lengte nog geen dominerende rol kan spelen wat betreft de bindingskracht. |
(**) |
Ook QIAamp is een toepassing van deze technologie.
|