Electroferogram

Het electroferogram, dat in ARA852#10 is aangetroffen moet er zo uitzien:

electroferogram#10

Reconstructie (*) van het DNA-profiel, verkregen uit vlek#10. In dit profiel komen vier kenmerken voor, die EL deelt met vijf kenmerken van het slo (groene pijlen). Er zijn echter ook een aantal piekjes, die niet in het profiel van EL thuis horen. Vier dragen het kenmerk "am". Drie hiervan passen precies in het profiel van het slo. Deze werden door de NFI-deskundige D.A. Kloosterman van het kenmerk "am" voorzien (added manually), doch hij verzuimde hierbij ook de code "W" te vermelden, om aan te geven, dat zij matchen met het profiel van de weduwe. Het vierde hier aangegeven extra piekje kreeg geen nadere aanduiding, maar viel wel samen met het profiel van W (zie verderop).

De gele cirkels duiden sporen aan, waarin geen bijdrage van het slachtoffer is gevonden. De mogelijke reden hiervan wordt in deze paragraaf uiteengezet.
* naar Gilder in Derksen 2011 (Leugens over Louwes), pagina 306

Hier valt dus op dat er drie/vier piekjes in het profiel van het slachtoffer vallen en niet in het profiel van EL. Omtrent die drie piekjes zal zijn geredeneerd, dat het er maar drie zijn, waar zijn dan de overige piekjes uit het profiel van het slachtoffer? Ofwel, die drie piekjes zijn 'weggestreept' als toevalligheden.
Maar klopt dit wel? Waar zouden die andere piekjes hebben moeten liggen? Nu komt de aap uit de mouw:

De gevonden am-piekjes liggen allemaal links, dus betreft allemaal piekjes, die als eerste bij de analyse verschenen in de zogenaamde detector.
Daarnaast geldt voor de kenmerken D3-16(^o) en D8-14 van de weduwe, dat ze "homozygoot" zijn, dus twee gelijk in beide chromosomen en daardoor extra goed zichtbaar. D19-14 en D19-14.2 liggen onderling op slechts "halve" afstand, en kunnen elkaar versterkt hebben, gezien de lage resolutie.
Een groot aantal van de te verwachten volgende piekjes van het slachtoffer bevinden zich onder de reeds bestaande pieken van EL en kunnen daar onmogelijk worden gedetecteerd. Immers, op de met groen aangewezen plaatsen, hebben EL en het slachtoffer gemeenschappelijke kenmerken liggen.
Voorts zouden zij soms ook heel dicht bij pieken van EL liggen, waardoor zij de kans lopen te worden aangezien voor zogenaamde 'artefacten', dwz. signalen die ontstaan door storingen in de detectie, willekeurige piekjes door schommelingen in de omgeving (elektrische storingen bijvoorbeeld), 'pull-ups', waarbij een piek 'doorschijnt ' in het verkeerde kleurkanaal en 'stutters', die kunnen ontstaan doordat het PCR-proces soms een rijtje basen verliest tijdens het kopiëren.
Dit geldt voor het kenmerk D16-11, dat precies de stutter-positie voor D16-12 inneemt. Voor D2-23 geldt hetzelfde ten opzichte van de piek van Louwes D2-24.
Dit zal vermoedelijk gelden voor de loci (aangeduid met de grijze velden), waarin ook de gemeenschappelijke kenmerken liggen (dus aangeduid met groen). Zie de appendix onderaan.
Daarnaast zien wij in het electroferogram een trend, die wij veel vaker zullen zien bij het systematisch bekijken van andere electroferogrammen: naar rechts toe wordt de piekhoogte gemiddeld fors veel kleiner. Dus is de kans om 'kopje onder te gaan' in het geweld van artefacten, achtergrond en wat dies meer zijn nog groter. Let op, hoe laag de pieken zijn in de gele ovalen, vergeleken met zijn pieken links.

(^o)De aanduiding van piek D3S1358-16 kort men af tot D3-16 enzovoort.

Om dit laatste te verduidelijken, kijken wij eerst naar de techniek van het maken van zo'n electroferogram (Eng.: electropherogram).

Nadat via PCR (paragraaf 6.2.2) de diafragmenten die onderzocht worden bij forensische analyse zijn geselecteerd en vermeerderd, wordt het ontstane preparaat in de capillair van het geautomatiseerde electroforese-apparaat gespoten:

Werking van de analyzer (ABI PRISM 310). Zie: http://www.nfstc.org/pdi/Subject05/pdi_s05.htm

De verschillende onderdelen van zo'n monster zijn dus niet allemaal even lang onderweg. De langzaamste fragmenten zijn ongeveer 2x zo lang onderweg, dan de kortste. Dat betekent, dat zij tweemaal zo lang de tijd hebben, om zich door temperatuursbewegingen over de naaste omgeving te verspreiden. Voorts kruipt zo'n latere piek veel langzamer langs de detector, want zijn snelheid is navenant lager. Dan gebeurt er iets vervelends: de piek van zo'n fragment wordt onscherper; breder en dus lager:

Uitgaande van een omgekeerd evenredig verband tussen piekhoogte en migration time op grond van de besproken factoren als pieksnelheid en diffusie kan de evolutie van de piekhoogte worden voorspeld.

Maar voordien hebben zich nog twee andere problemen voorgedaan:

Tijdens de PCR zullen niet alle kopieer-reacties onmiddellijk starten. Het opstarten van reacties is een stochastisch (= op toevalligheden berustend) proces, waardoor het mogelijk is, dat bepaalde kopieeracties niet afgerond worden binnen de daarvoor beschikbare tijd; het PCR proces is een proces, dat wordt gedicteerd door een op- en neergaande temperatuur beweging. Het gevolg hiervan is, dat langere fragmenten meer kans bieden op de mogelijkheid, dat het kopieerproces niet is afgerond en een fragment wordt geproduceerd, dat deel wordt van de achtergrondruis.
tijdens de gebruikte injectie-methode (elektrokinetische injectie) worden vooral de meest beweeglijke deeltjes opgenomen in de capillair. Dus eigenlijk een soort electroforese, om de electroforese te kunnen beginnen. Dit proces trekt de kleine deeltjes voor. Ook hierdoor worden de pieken aan de linker kant van het uiteindelijk gevormde electroferogram "bevoordeeld".

Het gevolg is een afnemende piekhoogte naar rechts in een electroferogram. Ik heb er een aantal bekeken en de resultaten hiervan in een diagram weergegeven - het effect is dramatisch:

Piekhoogten in samenhang met plaatsing van de pieken in een aantal willekeurige electroferogrammen. Onder aan de pagina is een soortgelijk diagram van een testmonster opgenomen met eenzelfde resultaat.

Dit alles blijkt al eerder geconstateerd, in http://www.bioforensics.com/articles/champion1/champion1.html:

Degeneratie ter verklaring.
Hier wordt hetzelfde effect gesignaleerd. De piekafname wordt hier verder geaccentueerd, doordat de pieken aan de rechter zijde corresponderen met langere DNA-fragmenten, voordat deze werden gekopieerd. Langere DNA-fragmenten zijn op basis van pure kansrekening meer vatbaar voor degeneratie. In de DMZ is dit een belangrijke factor (4 jaar!).
Zie appendix voor resultaten, waarbij degeneratie is uitgesloten.

Samen met de eerder genoemde factoren, is hiermee het fenomeen afdoende verklaard.

In dit artikel wordt een casus opgevoerd, die als twee druppels water lijkt op de casus van vlekje #10:

Doordat de ene bijdrage van het DNA-spoor zulke hoge pieken veroorzaakte, werd de tweede bijdrage gemaskeerd. In het geval van vlekje#10 doet zich precies hetzelfde voor. De pieken in vlekje #10 zijn erg sterk.

D8S1179-13 en D8S1179-16 zijn met een beetje goede wil nog in het bovenste diagram zichtbaar. D21811-32.2 is echt niet te zien daar. In D8S1179 is nu ook het DNA van het slachtoffer zichtbaar.

Zie, hoe sterk ook in het getoonde deel-electroferogram de piekhoogte naar rechts afloopt!

Het fenomeen staat bekend onder twee namen, de ski-helling en de degradatie-helling. In deze uiteenzetting nogmaals de oorzaken: A ski slope is not necessarily a degradation slope.pdf

Een concreet voorbeeld

Hoe pakt dit nu uit in de praktijk? In de volgende illustratie is het electroferogram van spoor #10 herhaald, nu onmiddellijk gevolgd door het diagram van spoor #6. Spoor #6 is in zijn totaliteit alleen toegeschreven aan het slachtoffer. Het is incompleet, een incompleet profiel kan dus ook. In spoor #6 heb ik met verschillende kleurcodes een aantal pieken aangeduid, waarvan ik in spoor #10 heb aangeduid, hoe het spoor zich daar zou manifesteren, indien spoor #10 een mengprofiel zou zijn van Louwes en van spoor #6.

Onder: spoor #6. De rood aangeduide sporen zijn ook in spoor #10 (boven)zichtbaar. De groen aangeduidde sporen vallen in spoor #10 samen met daar aanwezige pieken van Louwes. De blauw aangeduidde pieken vallen opposities, die in spoor #10 ook als stutterpieken kunnen worden geduid. In zo'n geval is een specifieke toewijzing aan de één of de ander nietmogelijk. De bruin aangeduide pieken staan op posities, die in diagram #10 onmiddellijk zouden opvallen. Maar zijn daarin niet gesignaleerd. Een aantal van deze pieken zijn ook in spoor #6 niet gesignaleerd. Terwijlspoor #6 toch echt aan het slachtoffer werd toegeschreven. Omgekeerd kunnen een aantal - blauwe - pieken, die hier ontbreken gewoon in spoor#10 staan, zonder op te vallen. De redenen van ontbreken van dergelijke pieken staan hierboven beschreven.

Nog een voorbeeld

Hieronder staan twee electroferogrammen, nu gewoon als enkele diagrammen op een enkele x-as, dus alle pieken gewoon achter elkaar. Het bovenste diagram toont alle pieken in spoor #10. Het onderste diagram toont het referentiespoor van Louwes, gemaakt op basis van zijn wangslijmvlies met daardoor gemengd 5% van het referentie(bloed-)spoor van het slachtoffer. Zoek de verschillen.

Boven: De pieken in spoor #10. Onder: De pieken in het referentiespoor van Louwes, gemengd met het refentiespoor van het slachtoffer, waarvan een 5%-bijdrage is toegevoegd (in overeenstemming met de aanname, dat het bloedspoor in spoor #10 van het slachtoffer afkomstig is, zie de paragrafen 6.3 [rekenen] en 6.3.2. [vlek #10 uitgerekend]) Vanaf 200 basepairs duiken de pieken van het slachtoffer onder het detectieniveau van 50 RFU, ze verdrinken daar in de ruis van de basislijn.

Conclusie:

Er moet beter gekeken worden. Dan zal blijken -in zover dat eigenlijk niet al gebleken is, dat er TWEE DNA-bijdragen in spoor ARA852#10 aanwezig zijn, een sterk (primair) spoor en een zwak (secundair) spoor:

Het sterke spoor is ontegenzeggelijk van EL. Het kan veroorzaakt zijn door speeksel, zoals zoveel van zijn sporen wel moeten zijn veroorzaakt door speeksel, gezien het ontbreken van andere zichtbare aanwijzingen.
Het zwakke spoor is nu al via drie markers verbonden met het slachtoffer. Van het slachtoffer zijn rond de 20 bloedsporen aangetroffen, die met slechts heel weinig - of helemaal zonder- markers aan haar gekoppeld kunnen worden.

NIETS weerspreekt de stelling, dat het zichtbare bloedspoor in het uitgeknipte monster ARA852#10 de leverancier van het secundaire spoor is. Het zou de te falsificeren hypothese moeten zijn.

Appendix:

Afname piekhoogtes in een testmonster (9947A positif control sample; dus degeneratie uitgesloten):

Stutters zijn heel effectief in het 'verdonkeremanen' van een tweede profiel:


Electroferogram van een 'ladder' (groep DNA-fragmenten t.b.v. ijking) op de ABI PRISM 310. Opmerkelijk zijn de regelmatige afname van de piekhoogten en het optreden van duidelijke stutters. De meeste -4-stutters zijn onzichtbaar onder de naburige pieken. De -4-stutter van allel 9.3 zit onder de -1-stutter van allel 9 (die daardoor hoger is).	Nog een analyse uit dezelfde bron, maar nu met een wat bredere schaal, waardoor de afname in piekhoogte nog verder is geaccentueerd. In dergelijke gevallen (meting van een ijkmengsel) is degradatie uitgesloten. Dezelfde stutterpatronen zijn ook hier zichtbaar.
Zie: http://www.promega.com/geneticidproc/ussymp7proc/0717.html (1996).