PCR

In de discussie rond het DNA-bewijs speelt de techniek achter PCR in de toekomst wellicht ook een rol. Omdat daarnaast deze techniek op zich buitengewoon ingenieus is en interessant, hier vast een uitleg.

DNA

Een DNA molecuul bestaat uit twee strengen die tegen elkaar aanliggen. De strengen zijn elk opgebouwd uit een lange keten van achtereenvolgens een suiker en een fosfaat .

Aan elke suiker zit een stikstofbevattende base (de gekleurde ringen in de afbeelding links) die via waterstofbruggen vastzit aan een base uit de andere streng (de stippellijnen in de afbeelding rechts).
Hierdoor zijn de strengen spiraalsgewijs gedraaid, de zogenaamde dubbele helix.Er komen in het DNA vier basen voor: adenine (A), thymine (T), guanine (G) en cytosine (C). Tegenover een A zit altijd een T en tegenover een G altijd een C (zie de figuur rechts). Als je een DNA streng van het ene eind doorloopt naar het andere eind kom je een code tegen bestaande uit een opeenvolging van A's, T's, G's en C's. Alle erfelijke eigenschappen zoals oogkleur, haarkleur, huidkleur, lengte, enzovoort liggen vast in deze code.

Aangezien mensen niet allemaal dezelfde oogkleur, haarkleur, en huidkleur bezitten, verschilt de erfelijke code per persoon. En dit geldt dus ook voor de andere eigenschappen. Er zijn geen twee mensen met identiek DNA. Zelfs het DNA van een eeneiige tweeling vertoont verschillen. Van het DNA zorgt maar 2% voor de erfelijke eigenschappen (haarkleur, en dergelijke). De andere 98% is niet verantwoordelijk voor de erfelijke eigenschappen. Dat noemt men het "niet-coderende DNA.

STR

Op dat niet-coderende DNA -dat wegens de beperkte functie ook wel junk-DNA wordt genoemd- bestaan sommige plaatsen uit zich herhalende korte DNA-stukjes, bijvoorbeeld de herhaling CTG-CTG-CTG-CTG. Het aantal herhalingen van zo'n stukje zijn per persoon erg verschillend. Sommige mensen hebben vijf CTG herhalingen, terwijl een ander persoon hiervan negen herhalingen kan hebben. Die opbouw van die plaatsen (die hypervariabele gebieden heten) is dus per persoon uniek en daarom bij uitstek geschikt om iemand te identificeren. Dergelijke stukjes staan bekend onder de term Short Tandem Repeats = STR.
Als je van een persoon weet hoeveel herhalingen hij heeft op een bepaald stuk in zijn DNA, kun je die vergelijken met het aantal herhalingen van het DNA gevonden op het plaats delict. Wanneer het aantal herhalingen met elkaar overeen komen, heb je een match! Het DNA van het PD komt dus overeen met die van de verdachte.

Chromosomen

Om een DNA profiel te maken, kijk je niet naar één stuk herhalingen, zoals alleen de CTG herhaling. Je vergelijkt een aantal herhalingen op verschillende chromosomen. Chromosomen zijn in de celkern aanwezig als kleine bolletjes opgewikkeld DNA. Bij de mens tref je in de celkern 46 chromosomen aan. Ze zijn twee-aan-twee sterk overeenkomstig en bevatten genen met dezelfde 'opdracht'. Dat is alleen bij de celdeling te zien, want dan worden ze zij-aan-zij gerangschikt. Er zijn dus 23 paren. Van elk chromosomenpaar is één chromosoom afkomstig uit de spermacel van de vader en het andere chromosoom uit de eicel van de moeder. Chromosomen zijn opgebouwd uit lange draden DNA die op eiwitmoleculen zijn gewikkeld. Een DNA profiel geeft aan hoeveel herhalingen zich op een bepaald stuk op het chromosoom bevinden. Zo'n stukje chromosoom, waar voor onderzoekers een interessant stukje ligt, wordt een locus genoemd. Deze wordt aangeduid met een code, zoals: D18551. Op zo'n locus kunnen twee kenmerken worden bepaald, omdat er twee chromosomen zijn, die dit locus bezitten. Chromosoompaar 1 heeft bijvoorbeeld de code 8/4. Dit betekent bijvoorbeeld dat een persoon acht GTC herhalingen op het chromosoom 1 van zijn moeder heeft, en vier herhalingen op het chromosoom 1 van zijn vader of andersom, dat valt niet zomaar uit te maken. In het 23e chromosomenpaar zijn beide chromosomen bij een vrouw bijna aan elkaar gelijk, net zo als bij de andere 22 paren . Bij een man daarentegen bestaat het 23e paar echter uit één "groot" chromosoom en uit een aanzienlijk kleiner exemplaar. Het grote 23e chromosoom wordt aangeduid met de hoofdletter X en het kleine met de hoofdletter Y. Met andere woorden een vrouw is XX en een man XY. De X- en Y-chromosomen worden de geslachtschromosomen genoemd. De andere 22 chromosomenparen zijn de zogenaamde autosomale chromosomen. Ze zijn genummerd van 1 t/m 22. De twee chromosomen van één paar worden homologe chromosomen genoemd. Als iemand een afwijkend aantal chromosomen heeft, heeft dat vrijwel altijd ernstige gevolgen. Het bekendste voorbeeld is de aanwezigheid van 3 chromosomen 21. Het gevolg daarvan is het syndroom van Down.

PCR

Als je een DNA-profiel wilt maken van het DNA van bijvoorbeeld een verdachte, zul je dus per locus moeten bepalen uit hoeveel herhalingen deze locus bestaat. Het is helaas niet mogelijk om dit te bepalen door het DNA onder een microscoop te bekijken. Op de eerste plaats bevat het spoor vaak zo weinig DNA dat je het zelfs onder een microscoop niet zichtbaar kunt maken en op de tweede plaats zou je dan alle chromosomen zien. Je zou geen idee hebben waar de locus die jij wilt onderzoeken zich bevindt. Eerst moeten de uit het geïsoleerde DNA te onderzoeken loci vermeerderd worden om te bepalen uit hoeveel herhalingen (repeats) ze bestaan. De techniek die men hiervoor gebruikt heet de polymerase kettingreactie, ook wel afgekort als PCR (Polymerase Chain Reaction). Met deze techniek is het mogelijk om van het stuk DNA dat je wilt onderzoeken, meer dan één miljard kopieën te maken. Pas als je door middel van de PCR-techniek meer dan één miljard kopieën van alle loci hebt gemaakt kun je ze analyseren, zodat er en piekenpatroon uitkomt, een electroferogram.
Uit het geïsoleerde DNA kunnen alle elf loci tegelijk gekopieerd worden door middel van één PCR-reactie. Om de PCR-techniek uit te leggen, nemen we een voorbeeld waarin je slechts één locus zou willen kopiëren. Stel dat je het aantal herhalingen van locus TH01 op chromosoom 11 van een verdachte wilt onderzoeken.
Om te weten waar het kopiëren moet beginnen en waar het moet eindigen, moet je weten hoe de DNA- volgorde er uit ziet van het DNA dat vlak voor en vlak na de herhalingen in TH01 zit. Het aantal herhalingen in TH01 verschilt per persoon, maar de stukken die daar omheen zitten, blijken bij iedereen identiek (zoals eerder vermeld is 99,9% van het DNA van alle mensen identiek) Schematisch zien de twee ketens van elk chromosoom bij locus TH01 er zo uit:

Als je de code van de flankerende stukken weet, moet je het beginstukje en het eindstukje (vlak voor en achter de locus) door de PCR-leverancier laten maken. Deze korte stukjes DNA van 15 bouwstenen, de zogenaamde primers, passen precies op het begin en eind van de locus die je wilt kopiëren. Als je de primers toevoegt aan het DNA dat je geïsoleerd hebt, plakken de primers precies voor en achter de locus aan het DNA. Ze passen namelijk maar op één plek. Dat komt doordat een T alleen tegenover een A past en een G alleen tegenover een C. De primers geven als een soort vlaggetjes aan waar de locus begint en eindigt, zodat alleen de locus die tussen de twee primers ligt, gekopieerd wordt. De primers bepalen dus welke locus je kopieert. Aan deze primers zitten vervolgens weer verbindingsstukjes (linkers), en aan die verbindingsstukjes zitten weer lichtgevoelige stukjes, die een bepaalde kleur licht kunnen uitzenden, als ze door een laserbundel worden bestraald, de zogenaamde fluorescerende tags.

De cycli

Het kopiëren begint als je het enzym DNA-polymerase en de DNA-bouwstenen (de nucleotiden A, C, G en T) toevoegt. Alleen op de plaats waar een primer aan het DNA geplakt zit, kan het enzym beginnen met kopiëren. Het enzym DNA-polymerase plakt de juiste DNA-bouwstenen op de juiste plek, dus een A tegenover een T en een C tegenover een G. In de figuren hieronder zie je de PCR-reactie in vier fases afgebeeld.

Vervolgens begint de cyclus weer opnieuw: de temperatuur wordt verhoogd tot 95°C en alle strengen laten los. Nadat de primers gehecht zijn (bij 55°C) en vanaf die plek het DNA weer verdubbeld is (bij 72°C) heb je vier identieke stukken DNA, enzovoort… Het PCR-apparaat is nodig om steeds de juiste temperatuur voor het DNA en het enzym in te stellen. Door de temperatuur te variëren kan de hele cyclus (plaatje 1 t/m 4) meerdere keren achter elkaar uitgevoerd worden. Na 28 cycli heb je genoeg kopieën van de locus om te bepalen uit hoeveel herhalingen de locus bestaat. Dit wordt gedaan via capillaire electroforese (zie paragraaf 5.2.1).

Video PCR YouTube