DNA kwantificeren


Hoeveel DNA zit er in een spoor?

Het antwoord op die vraag is lastig en vereist veel geduld en nauwkeurigheid om deze vraag te beantwoorden. Een poging van het NFI (NFI-rapport dd. 21 april 2006) demonstreert dit overduidelijk:

Er kan een schatting worden gemaakt van het aantal cellen dat zich in een bepaald biologisch spoor bevindt. In deze zaak zijn voorafgaand aan de DNA-onderzoeken die zijn uitgevoerd in 2003 en 2004 de DNA-extracten van de bemonsteringen van de blouse aan een semi-kwantitatieve DNA-test onderworpen.(..) De semi-kwantitatieve test van het contactspoor van bemonstering [ARA852]#20 van de blouse geeft aan dat de DNA-concentratie in het extract van deze bemonstering ongeveer 0,03 nanogram (ng) per microliter (µl) bedraagt. De bemonstering [ARA852]#20 van de blouse is indertijd in 400 µl vloeistof geëxtraheerd. Dit betekent dat de bemonstering in totaal 400 x 0,03 = 12 ng DNA bevat. Bekend is dat de hoeveelheid DNA in een lichaamscel ongeveer 5 picogram (pg; 1 ng is 1000 pg) bedraagt. Dus, 12 ng DNA komt uitgaande van een hoeveelheid DNA van 5 pg per cel neer op circa 2400 cellen (12 ng gedeeld door 5pg)."

Het gaat hier om een spoor, dat volgens de NFI-gegevens met QIAamp werd geëxtraheerd (meer hierover in paragraaf 6.1.1). De berekening werd echter gebaseerd op de veronderstelling, dat de extractie met Chelex werd uitgevoerd. Bij gebruik van Chelex ontstaat 400 µl extract, bij QIAmp echter 50-100 µl, waardoor de berekening ineens 4 tot 8 x lager uitkomt. Ook is de hoeveelheid DNA in een cel eerder 7 dan 5 picogram.

Om meer zekerheid te verkrijgen omtrent de hoeveelheid in een monster is naast de vergelijking van de uitkomsten van de semi-kwanitatieve test ook een vergelijking gemaakt van de sterktes van de profielen. De semi-kwantitatieve test kent slechts een beperkt aantal afleesmogelijkheden (in stappen van x2), waardoor er eerder sprake is van intervallen, dan van waarden. Eerst moet geadresseerd worden, in welke mate de sterktes van profielen maatgevend zijn voor de hoeveelheid aangetroffen DNA.

Twee demonstraties van de evenredigheid van de sterkte van profielen en de hoeveelheid gemeten DNA. Links de uitleg van Butler, zo ongeveer de geestelijke vader van de capillaire electroforese. Rechts een afbeelding uit de manual van het door het NFI gehanteerde systeem.

Zoals hierboven zichtbaar is, is er een duidelijke relatie tussen de hoeveelheid DNA die in het PCR-apparaat wordt gebracht en de uiteindelijke waarden van het DNA-profiel in het electroferogram, zoals bij wijze van voorbeeld in paragraaf 6.3.1. is getoond. Zoals daar is uiteengezet, vertoont zo'n electroferogram een merkwaardige bijzonderheid, het diagram valt naar rechts toe gezien sterk af in piekhoogten. Afgaand op de gebruikte techniek is dat absoluut niet verrassend.

Analyse van de RFU-waarden in resultaten van het NFI in de Deventer Moordzaak in een aantal eenduidige sporen, vervaardigd met dezelfde technieken.


In de voorgaande diagrammen is gedemonstreerd, dat ook in de Deventer Moordzaak de electroferogrammen van links naar rechts afvallen. Niet allemaal op dezelfde manier, maar wel allemaal, waarbij opvalt dat het meest verse spoor - het kort daarvoor afgenomen wangslijmvliesspoor van Louwes (swab) - net zo sterk afneemt als het gemiddelde van de overige - ruim drie jaar oudere - sporen.



Voorbeelden van validatie-onderzoeken van vergelijkbare analyse-systemen, waarin gedemonstreerd wordt, dat binnen ieder locus de RFU-waarden goed correleren met de hoeveelheid ingebracht DNA.

Methode

Gebruikmakend van twee aspecten, de goede correlatie binnen dezelfde locus en het aspect, dat de kleinste fragmenten de duidelijkste representatie geven, heb ik per zogenaamde lane steeds één locus geselecteerd. Daarbij kwam de prettige omstandigheid om de hoek kijken, dat de pieken van zowel het slachtoffer als de heer Louwes in de heel duidelijke locus met de fraaie codering D3S1358 (blue lane) homozygoot zijn, dus steeds naar verhouding tweemaal zo groot als vergelijkbare andere pieken. Voorts is D8S1179 (green lane) gebruikt, die alweer voor het slachtoffer homozygoot is (de heterozygote pieken van Louwes heb ik opgeteld), evenals het locus D19S433 (yellow lane, dat tweemaal heterozygoot is).
Als we alle resultaten voor de relevante sporen met elkaar vergelijken, ontstaat er een zeer consistent plaatje:
De RFU-waarden van de drie genoemde loci in de drie verschillende 'lanes' zijn hier - de sporen in de Deventer Moordzaak - onderling gecorreleerd.

Kortom, de overtuiging is ontstaan, dat een goede inschatting kan worden gemaakt van de hoeveelheden DNA, die in de verschillende sporen aanwezig waren, althans in onderlinge vergelijking. 
Er liggen nog steeds twee problemen op de weg, om geruimd te worden:
  1. In een enkel monster werd extra PCR-product geïntroduceerd voorafgaande aan de electroforese
  2. en er werd vanaf spoor #11 een andere extractie-methode gebruikt.

Ik zal betogen dat 1. geen invloed op de analyses heeft, terwijl 2. vrijwel onschadelijk is, omdat het DNA-onderzoek bijna geheel in twee delen uiteen valt. Ten behoeve van de leesbaarheid breng ik deze onderwerpen onder in een appendix.
In de volgende stap zijn de RFU-waarden gerelateerd aan de grootte van de onderzochte sporen, zodat er in feite gekeken kan worden naar een relatieve 2-dimensionale concentratie aan DNA in de verschillende sporen. Hoe ervoor werd zorggedragen, dat de precieze oppervlakten werden bepaald, behandel in ook in de appendix (photoshop- methode).

Resultaat
Voor ieder spoor zijn de relatieve sterktes van de pieken in de drie eerder genoemde loci uitgezet. In sommige gevallen zijn de bijdragen in een spoor gesplitst naar donor of gespecificeerd naar donor (W of L).

Wat in een eerste blik opvalt, is dat de sporen waarover de meeste 'heisa' is ontstaan - de sporen #10 en #20 - in het ene geval heel sterk uit de bus komt (#10) en in het andere geval juist behoorlijk achterblijft (#20). In beide gevallen zal dit aanleiding zijn de gebruikte hypotheses te verwerpen.
Dat gebeurt in de volgende paragrafen.


Appendices

De hoeveelheid ingebracht PCR-product.

Voor de capillaire electroforese wordt 1µl van het PCR-product in een monsterbuisje met water of formamide gebracht en gebufferd, zodat de de zuurgroepen hun proton verliezen. Dat geldt voor de door kopiëren gevormde DNA-fragmenten, maar ook voor de ongebruikte bouwstenen, die ook van nature vrijwel net zo zuur zijn. Brengt men meer PCR-product in het monsterbuisje, dan vermeerdert men automatisch ook de concurrentie. De concurrentie bestaat uit kleinere moleculen, waardoor er geen voordeel ontstaat voor de bedoelde DNA-fragmenten, die meer dan 100x zo omvangrijk zijn.

Links de werking van de electrokinetische injectie. Tijdelijk worden electrode en capillair in het monsterflesje gedompeld om wat ionen uit het mengsel te vissen. Rechts een onderzoek van Butler (diagram nagetekend). Hier is te zien, dat het aanbieden van meer PCR-product contraproductief werkt, tenzij men werkt met inferieure oplosmiddelen (rechter metingen).

De monstername aan de start van de electroforese vindt plaats door het aanleggen van een spanningsveld tussen (een electrode in) het monsterflesje en het uiteinde van de capillair, waarin zich een scheidende gel bevindt. In feite vindt er op dat moment 'in het klein' een extra electroforese plaats: er wordt steeds een overmaat aan meer kleine deeltjes in de gel opgenomen, één van de oorzaken voor het 'afvallen' van de diagrammen, zoals eerder is gedemonstreerd (zie het voorbeeld in paragraaf 6.3.1.). De hoeveelheid opgenomen PCR-product wordt bepaald door de heersende stroomsterkte en de duur van het bemonsteren, de zogenaamde injectietijd (Q = i * t). De hoeveelheid ionen die beschikbaar is, maakt in principe geen deel uit van deze formule. er kunnen nooit te weinig ionen zijn, want dat is bijvoorbaat geregeld in de samenstelling van het mengsel, dat in de PCR wordt samengebracht. Voor eventuele verschillen in injectietijd t heb ik wel consequent gecorrigeerd. De hoeveelheid PCR-product variëren helpt dus niet, hetgeen het NFI zelf heeft geverifieerd!
Twee onderzoeken binnen een onderzoek. Hier onderzocht het NFI de mogelijkheid een betere opbrengst aan DNA-pieken te krijgen met grotere volumina aan PCR-product, ondanks dat al lang bekend en aangetoond was (bijvoorbeeld door de eerder genoemde Butler), dat dit niet werkt.

De gebruikte extractie-methodes

Er werden twee extractie-methoden gebruikt, Chelex voor de eerste 10 sporen en QIAamp voor de overige 10. Het verschil in resultaat tussen beide methoden laat zich als volgt karakteriseren:

  1. Chelex bevat meer DNA in een aanzienlijk groter volume (400 µl)
  2. QIAamp bevat (iets) minder DNA bij een aanzienlijk grotere concentratie (volume 50 - 100 µl)

Omdat in beide gevallen ruimschoots voldoende voldoende volume wordt geproduceerd voor het PCR-proces, is QIAamp dus gewoon effectiever.Bij het vergelijken van sporen uit de reeks 1 -10 met de reeks 11 - 20 moet hier rekenschap van gegeven worden.

Photoshop

Met Adobe Photoshop Elements is het mogelijk een aantal bepalingen te doen, die zeer behulpzaam zijn bij het bepalen van een aantal kenmerken van de genomen monsters. De gelukkige omstandigheid doet zich voor, dat vrijwel alle monsters zijn gefotografeerd vóór en na het uitknippen. Daarmee valt bijvoorbeeld vast te stellen, hoe groot een bloedvlek was, en welk deel ervan in de bemonstering kwam. Daarnaast bezit de blouse een bijzonder nuttig kenmerk: er staat een stippeltjespatroon op met nauwkeurig bekende afmetingen. Door steeds de virtuele oppervlakte van een zeshoek op de blouse te meten en te vergelijken met de werkelijke oppervlakte van deze zeshoek (4.06 cm2 groot), kan iedere oppervlak worden geijkt, of de blouse nu recht van boven is gefotografeerd of onder een hoek.
Verschillende stadia van het Photoshop onderzoek. Zodra een gekleurd vak wordt geselecteerd, kun je in Photoshop van die selectie het aantal pixels en de luminantie van die pixels aflezen (beide met de optie [Image] > [Histogram...]).
Zie toe, dat er voor spoor #10 in dit voorbeeld twee manieren zijn om de oppervlakte van het spoor te definiëren.