Goochelen met DNA

Er zit iets vreemds met dat spoor #20. Zoals in de bovenliggende paragraaf al is aangeduid, stelde Dr. Kloosterman in het NFI-rapport van 19 januari 2004, dat vlek #20 zich op de rechter van de blouse bevond (pagina 5/10):

Verderop (pagina 8/10) vinden de uitslag van het onderzoek:

Blouse ARA852#20      Mengsel van celmateriaal van slachtoffer en verdachte

Tenslotte volgt op pagina 9/10 nog een bespreking van dit spoor:

Van het mengprofiel van het celmateriaal in bemonstering ARA852#20 van het rechter voorpand van de blouse kan het volledige DNA-profiel van een mannelijk individu worden afgeleid. Dit afgeleide profiel komt overeen met het profiel van de verdachte Louwes. (..)

Van een vergissing lijkt geen sprake te zijn, alle overige sporen aan de rechter zijde van de blouse staan correct vermeld als zijnde aangetroffen op de rechterzijde van de blouse, gezien vanuit de denkbeeldige draagster van de blouse.

Vervolgens gaat het helemaal fout, want in het NFI-rapport van 22 januari 2004 toont ing. Eikelenboom een overzicht van de sporen. Dit overzicht ziet er als volgt uit (foto licht bewerkt):

Foto 1: Het slachtoffer op de plaats delict.
De blauwe cirkels geven de locaties aan waar bemonsteringen van lichtrode substanties zijn genomen.
De groene cirkels geven crimescope-positieve vlekken aan die zijn bemonsterd.
In beide kleuren cirkels zijn DNA-kenmerken van een mannelijk individu aangetroffen.
De rode cirkels geven de locaties van de controlemonsters aan.
De zwarte cirkels geven de locaties aan van de bemonsteringen waaruit f een DNA-profiel werd verkregen, mogelijk afkomstig van het slachtoffer, f geen profiel.

Ineens blijkt er een spoor op de linker helft van de blouse bijgekomen te zijn, de blauwe cirkel rechts onderaan (voor de toeschouwer). Overigens zonder enige aanvullende toelichting in het rapport. Toch staat er doodleuk op pagina 14 van dit rapport:

"Voor een nadere specificatie met betrekking tot de herkomst van het aangetroffen DNA in de bemonsteringen wordt verwezen naar de DNA-rapportage van dr. A.D. Kloosterman."

Er wordt dus NIET verwezen naar enige discrepantie met het rapport van 19 januari 2004.
Wel stelt ing. Eikelenboom in zijn toelichting (d.d. 26 januari 2004) dit:

"Vlek #20 bevindt zich op de rechter voorzijde van de blouse, op slechts enkele centimeters van de bovenste steekwond."

Dit zonder te vermelden, dat dit inhoudt dat er nu een gedeeltelijke discrepantie is met het rapport van Kloosterman (niet het noemen van de term rechts, maar de associatie met de steekwond, die links was aangebracht).

Ook in het arrest van Den Bosch d.d. 9 februari 2004 is de verwarring nog steeds ten top:

"2.1.7.(..)
Spoor #20 is, naar ing. Eikelenboom ter zitting van 26 januari 2004 heeft verklaard, op de rechtervoorzijde van de blouse aangetroffen op slechts enkele centimeters van de bovenste steekwond. Dat hier de mannelijke donor in het mengprofiel overheerst duidt erop dat deze donor aanmerkelijke kracht heeft uitgeoefend."

Ook het Hof blijkt helemaal niet door te hebben, dat de steekwonden aan de linker zijde waren aangebracht en de locatie van vlek #20 nog steeds als rechts op de blouse staat aangegeven.
Pas tijdens het orinterend onderzoek 2006-7 en de gelijktijdig lopende herzieningsaanvraag werd deze discrepantie geadresseerd.  In het OO-rapport van 6 juni 2006, dat in deze periode verscheen staat vlek #20 ineens aan de linker zijde van de blouse geplaatst, met een begeleidende voetnoot:

"Uit het door ons verrichte onderzoek is gebleken, dat abusievelijk in het rapport van het NFI van 19 januari 2004 is vermeld dat dit spoor op het rechter voorpand is aan getroffen. Deze verschrijving heeft geen gevolgen voor onze hierna te melden conclusie."

Formeel is deze opmerking hier geplaatst door de officier van justitie bij het Landelijk Parket te Rotterdam en de inspecteur van de regiopolitie Utrecht, die gezamelijk tekenden voor dit rapport. En nu kun je je afvragen, op grond van welk onderzoek zij deze conclusie meenden te mogen trekken? Wij weten het nog steeds niet. Wel weten wij, dat deze 'vergissing' vrreikende gevolgen had, want spoor #20 werd als incriminerend opgevat en kreeg meer gewicht door zijn 'aparte' locatie. Dit ondermeer, doordat getuige dcharge Dr. P. de Knijff duidelijk werd overrompeld door dit gegeven.
Het moge duidelijk zijn, dat de onduidelijkheid betreffende zijn locatie spoor #20 ineens van nul en generlei waarde maakt.

Maar er zijn verdere inplicaties of associaties, met name gezien het zogenaamde DNA-zakenformulier, dat in het boek van Derksen (Leugens over Louwes - 2011) opdook. Dit formulier begeleidt het DNA-onderzoek in de monsters, die van de blouse werden uitgeknipt. Hier gaat het om de aangebrachte correctie in kolom 1 (geel gemarkeerd):


Het DNA-zakenformulier

Het DNA-zakenformulier van de tweede reeks DNA-onderzoeken minus spoor #20, dat paste er net niet meer op. In de eerste en vijfde kolom zijn stickers geplakt. In de eerste kolom zijn de stickers vanaf spoor #14 ineens onleesbaar geworden. Op sticker #14 is met enige moeite nog de waarde 14 afleesbaar, daaronder lukt het niet meer of lijkt het niet meer overeen te stemmen. In de marge is deze kolom opnieuw genummerd, in overeenstemming met kolom 5. Het lijkt erop, dat de etiketten zijn gewist. Als dat zo is, dan kan deze correctie  haast niets anders betekenen, dan dat het originele formulier een afwijkende volgorde van nummers in kolom 1 vertoonde.

Een andere mogelijkheid is nog verontrustender. Misschien kwamen de etiketten onleesbaar uit de labelprinter rollen en werden ze - zonder de labels goed te controleren - snel op het formulier, op de blouse(*) en op de cuvetten geplakt. Dan is de verwisseling van de sporen wel hl verklaarbaar geworden.

In ieder geval bestaat er vanaf spoor #14 geen zekerheid meer over de relatie uitgeknipt blousemonster - verkregen DNA extract, ofwel de chain of custody is verbroken. Vermoedelijk zette deze verbroken relatie zich voort op de volgende pagina met vlek #20. Hiermee is de merkwaardige switch van vlek #20 van links naar rechts begrijpelijk geworden. Alleen is dan niet meer duidelijk, welke vlek nu eigenlijk vlek #20 was.

(*)Op de blouse zijn op opeenvolgende foto's meerdere generaties van etiketten zichtbaar. De uiteindelijke etiketten zijn handgeschreven en hebben dus geen fysieke relatie met de onderzochte monsters.



Semi-kwantitatief


Er bestaat nog een aanwijzing voor de verwisseling van sporen. Zoals te zien is op het DNA-zakenformulier (kolom 7, rood gemarkeerd), is er sprake van een concentratiebepaling. Bij de sporen #10, #12 en #18 staat daar een waarde ingevuld; de overige sporen zijn voorzien van de waarde "<0,03" (ng/L). Deze laatste waarde geeft dus aan, dat de concentratie onder een bepaald minimum is gedaald, naar zo zal blijken, de drempelwaarde van de gebruikte meetprocedure.
Voor spoor #20 bedroeg deze waarde 0,03 ng/L. Deze waarde dook ook op tijdens het zogenaamde orinterend onderzoek van een paar jaar later. Deze tekst werd vanwege het NFI in 2006 vrijgegeven:

"Er kan een schatting worden gemaakt van het aantal cellen dat zich in een bepaald biologisch spoor bevindt. In deze zaak zijn voorafgaand aan de DNA-onderzoeken die zijn uitgevoerd in 2003 en 2004 de DNA-extracten van de bemonsteringen van de blouse aan een semi-kwantitatieve DNA-test onderworpen.(..)
De semi-kwantitatieve test van het contactspoor van bemonstering [ARA852]#20 van de blouse geeft aan dat de DNA-concentratie in het extract van deze bemonstering ongeveer 0,03 nanogram (ng) per microliter (l) bedraagt. De bemonstering [ARA852]#20 van de blouse is indertijd in 400 l vloeistof gextraheerd. Dit betekent dat de bemonstering in totaal 400 x 0,03 = 12 ng DNA bevat. Bekend is dat de hoeveelheid DNA in een lichaamscel ongeveer 5 picogram (pg; 1 ng is 1000 pg) bedraagt.
Dus, 12 ng DNA komt uitgaande van een hoeveelheid DNA van 5 pg per cel neer op circa 2400 cellen (12 ng gedeeld door 5pg). "

Hier wordt melding gemaakt van het volume, waarin het DNA-monster werd gextraheerd. Maar dit is slechts de eerste stap om te komen tot het DNA-preparaat, dat de PCR ingaat. Het extract wordt namelijk vervolgens door een mini-kolom 'geperst', waaraan het DNA zich hecht, zodat het wordt afgescheiden van allerlei onzuiverheden. Vervolgens wordt deze kolom nagereinigd, waarna het DNA weer van deze kolom 'losgeweekt'. Dan ontstaat een zogenaamd eluaat, dat wordt onderzocht op aanwezig DNA.



De minikolom van QIAgen.
Het extract wordt bovenin ingebracht. Na een of meer wasbehandelingen en verschillende centrifuge beurten wordt uiteindelijk een speciale vloeistof (eluens) toegevoegd, die het gezuiverde DNA weer van de speciale laag (de eigenlijke minikolom) onderin het inzetbuisje losweekt. Deze vloeistof wordt het eluaat genoemd. De hoeveelheid eluaat hangt af van het door de onderzoeker beoogde resultaat: veel DNA in verdunde toestand, of minder DNA, maar dan lekker geconcentreerd.
De hele procedure leidt tot zuivering - en zo men wenst - ook tot concentratie van de aanwezige DNA.

Die nadere analyse bestaat uit het zogenaamde semi-kwantitatieve onderzoek en dan - na vermenigvuldiging in de PCR - uit electroforese, om een piekenpatroon te generen. De hoeveelheid extractievloeistof bedraagt 400 l, afgaande op de gebruiksaanwijzing van QIAgen in 2003. Maar de hoeveelheid eluens/eluaat kan heel anders zijn, standaard wordt 200 l toegepast. Hierover vermeldt de gebruiksaanwijzing onder meer het nu volgende:

For some downstream applications, concentrated DNA may be required. Elution with volumes of less than 200 μl increases the final DNA concentration in the eluate significantly but slightly reduces overall DNA yield (see Table 4, page 16). For samples containing <3 μg of DNA, eluting the DNA in 100 μl is recommended. For samples containing less than 1 μg of DNA, only one elution in 50 μl Buffer AE or water is recommended.

Nu vormt de door het NFI opgevoerde 12 ng slechts 1,2 % van 1 μg, de drempelwaarde, waarbij QIAgen voorstelt het eluaat te beperken tot 50 μl. Als het NFI deze raad heeft opgevolgd, had zij dus niet de beschikking over 12 ng DNA, maar volgens de eigen rekensom slechts over 1,5 ng, hetgeen op zich veel beter zou passen bij de uiteindelijke uitkomst van de DNA-analyses. Trouwens, de hoeveelheid eluens kan wel vooraf worden bepaal, maar de hoeveelheid eluaat is altijd kleiner en onzeker.
De hoeveelheid eluaat, benodigd voor de PCR die daarop volgt is vij klein. Standaard is het totale PCR-volume 50 μL, waarvan zo'n 20 μL bestaat uit het toegevoegde eluaat. Er is ook sprake van experimenten met een kleiner volume, indien slechts weinig DNA beschikbaar lijkt, zoals in het onderhavige geval. Door te werken met kleine hoeveelheden in hoge concentraties werden alsnog redelijke resultaten bereikt. In de verslaggeving van het NFI ontbreken dergelijke details en het is maar de vraag, of die nog bekend zijn. Het ligt voor de hand, dat er zo weinig mogelijk eluaat werd geprduceerd om een zo'n duidelijk mogelijk resultaat te verkrijgen.

Het is van tween n: of het NFI gebruikte inderdaad het extract (de oorspronkelijke 400 μL) voor de kwantitatieve bepaling. Maar dan is de uitkomst van deze bepaling van nul en generlei waarde, want zo'n extract is nog zwaar verontreinigd. Of het NFI gebruikte het eluaat voor deze bepaling, maar dan verkeren wij in volstrekte onzekerheid omtrent het volume ervan. Dat staat hier namelijk niet geregistreerd, zie het formulier.

Correlatie





QuantiBlot methode van Applied Biometics. De laagste waarde, die met deze methode kan worden gedetecteerd bedraagt 0,03  ng/L (variant ECL).  Kloosterman 2001 (DNA als  gerechtelijk bewijsmateriaal) maakte melding van het gebruik van een dot-blot voor semi-kwantitatief onderzoek ter bepalingng/L van de hoeveelheid benodigd extract voorafgaand aan PCR-vermenigvuldiging. Omdat het NFI ook voor de andere DNA-methoden gebruik maakte van materiaal van Applied Biometrics en de opeenvolgende meetwaarden geheel overeenstemmen met de in NFI-bronnen genoemde meetwaarden, mogen wij aannemen, dat dit de gehanteerde methode is.


De  correlatie tussen de Quantiblot waardene en de RFU's is soms heel slecht.

Het NFI heeft daar wel een mening over, gelezen het artikel Kwaliteitsbewustzijn zit in de genen(*) (mijn nadruk):

DNA-kwantificering. Omdat de hoeveelheid DNA per bemonstering afhangt van de hoeveelheid biologisch materiaal in de bemonstering, verschilt ook de hoeveelheid DNA per DNA-extract. Een extract wordt daarom gekwantificeerd: het bepalen van de concentratie humaan DNA. Dit is een noodzakelijke stap in het proces, want voor de uiteindelijke DNA-analyse is een bepaalde optimale hoeveelheid DNA nodig. De kwantificering dient bovendien als controlestap; van een grote hoeveelheid biologisch materiaal in een bemonstering wordt ook een hoge DNA-concentratie verwacht, terwijl van een kleine hoeveelheid biologisch materiaal in een bemonstering een lage DNA-concentratie wordt verwacht. Een afwijking in de verwachte DNA-concentratie en de hoeveelheid biologisch materiaal kan een indicatie zijn dat ergens in het proces iets verkeerd is gegaan en dat controle noodzakelijk is.

Als er dan ook nog eens sprake is van onleesbare etiketten en verwarring rond de locatie van een cruciaal spoor...

(*) Forensisch DNA-onderzoek bij het Nederlands Forensisch Instituut. Door ir. B.J. de Jong, ing. A.M. van der Ham-Quak, prof. dr. A.D. Kloosterman en dr. W.M.M. Heijnen 2013.



Foutje, bedankt

Een incident? Kijk eens naar het volgende fragment, de eerste pagina van een overzicht van aangetroffen fouten bij het NFI - door het NFI zelf. Let daarbij op de opeenvolging van data, waarop de fouten werden gemaakt, nogmaals, voor zover teruggevonden:

In 2011 wist De Telegraaf een rapport in handen te krijgen over fouten die intern bij het NFI waren aangetroffen door het NFI zelf. Het werkelijke aantal fouten lag dus logischerwijs hoger.
In 14 jaar werd 1650 onregelmatigheden geconstateerd. In 2010 beliep het aantal onregelmatigheden 1,3 % van alle onderzoeken. 180 keer werden monsters verwisseld - voor zover onderkend. Voorts, zie http://www.leugens.nl/2011/09/11/dna-onderzoek-van-het-nederlands-forensisch-instituut/ en https://www.scribd.com/doc/111330612/100911-Nfi-Meldingen. 

Het NFI heeft gereageerd, maar helaas werken de links in de reactie niet langer. Wat ook niet helpt, is dat er recent weer een verwisseling werd ontdekt, niet binnen een onderzoek, maar tussen twee onderzoeken. Een fout binnen een bepaald onderzoek wordt uiteraard veel sneller gemaakt en onttrekt zich al gauw aan een mogelijke ontdekking. Voorts is het saillant, dat over de jaren 2003 en 2004 geen rapportages zijn gepubliceerd.

Appendix, de Raad voor Accreditatie

Ieder jaar wordt het NFI ook extern doorgelicht. De rapporten zijn op de website van het NFI terug te vinden, behoudens die van 2003 en 2004. Het NFI stelt op zijn website:
"In de jaren 2003 en 2004 zijn geen rapportages verschenen." Hieronder geef ik een bloemlezing van de bevindingen in 2006:

RvA Afwijkingenformulier (Raad voor Accreditatie)
D.d. 9 en 10 oktober 2006 (Rapportcode L146-C03.1)
Afdeling Biological Traces and DNA Typing

Definities/beschrijving 1e en 2e lijnscontroles in gebruik ontbreken. Naamgeving in de documentatie is daarom niet consequent. Het gebruik van controlemonsters en het toepassen van controlestappen is niet altijd beschreven.
(..)
Verleende bevoegdheden t.a.v. de kwantificeringsprocedure blijken niet uit bevoegdhedenmatrix en inwerkformulieren voor meerdere personen.
(..)
Er vindt geen aparte registratie plaats van referentiematerialen. Ook geen gescheiden opslag van deze materialen.
(..)
Het werkvoorschrift is niet opgesteld conform de werkwijze voor DNA-typeringen. Administratieve handelingen ontbreken, gebruik van formulieren, werklijsten en archivering zijn niet beschreven. Gebruik controlemonster niet correct omschreven.
(..)
Verwijzingen naar andere documentatie is incorrect of onvolledig.

Dit werd dus in 2006 opgemerkt.
In 2007 werden de volgende opmerkingen gemaakt:

Rapport vervolgonderzoek NFI L146-T7
Datum onderzoek: 1 en  november 2007
Tijdens het onderzoek zijn 9 afwijkingen vastgesteld, alle van categorie B.

(..)

Bij analyse van profielen in (onleesbaar gemaakt) wordt onvoldoende onderscheid gemaakt tussen vaste regels en richtlijnen.

Acties voor niet alle rule sets zijn beschreven. Beschreven acties zijn regels maar soms ook richtlijnen, een duidelijk onderscheid wordt niet gemaakt. Relatie met het document Interpretatie van DNA profielen ( waar naar verwezen wordt en waar de interpretatie voor referentieprofielen beschreven is) is onvoldoende bepaald.

(..)

Omvang van de afwijking (range of deviation):
QOL-00023 Interpretatie DNA profielen met behulp van (onleesbaar gemaakt)
QOL-122136 Interpretatie van (onleesbaar gemaakt) LCN DNA-profielen
QOL-122141 Interpretatie van DNA-profielen
QOL-122147 Interpretatie van Y-STR DNA-profielen

(..)

Vervolgens wordt beschreven, hoe de situatie is verbeterd en geconcludeerd:

De afwijking is opgeheven.

Maar dan is het inmiddels eind 2007! Op welk moment de afwijkingen zijn opgetreden en of deze ook ten tijde van het onderzoek in de Deventer Moordzaak golden, kan slechts worden nagegaan, door de eerdere audits te raadplegen. Maar helaas, de reeks documenten is niet volledig...

Overzicht van externe audits door de Raad voor Accreditatie (RvA), zoals gepubliceerd op de website van het NFI. Zowel de opeenvolging in data, de opeenvolging in nummers, de interne verslaggeving van het NFI (zie hieronder) en mededelingen van de zijde van de RvA, bevestigen dat er tenminste n rapport ontbreekt en wel net in de periode van het DNA-onderzoek in de Deventer Moordzaak.


Dus nog maar eens terug naar de interne controles. De afdeling Humane Biologische Sporen (HBS, waarbinnen het DNA-onderzoek valt) van het NFI rapporteert de meldingen sinds 1997. In de periode van het onderzoek Deventer Moordzaak (december 2003, januari 2004) zijn de meldingen ineens opvallend afwezig. Wel vinden wij hier deze mutatie:


Het gaat hier dus over de externe audit, die het NFI niet op haar website heeft staan! Bekijken we de rest van de meldingen, dan vinden wij van bijkans alle in dit hoofdstuk gesignaleerde afwijkingen wel een voorbeeld.

We zitten ergens tussen transparantie en cover-up. Bepaalt u zelf maar waar.